Waterhouse 认为,RISC 复合体就象守门卫士一样呆在核孔或细胞膜内,检查每个从核孔出来的mRNA ,如为其识别,就将其降解,产生基因沉默[17 ] 。Celotto 等在研究果蝇Dscam 基因时发现, Dscam 基因可以根据不同的剪切产生多个不同的成熟mRNA ,根据外显子合成的双链RNA 分子只能诱导含有该外显子的mRNA 的降解,对不含该外显子的mRNA 没有作用。说明RNA 干涉仅识别成熟mRNA ,即在mRNA 编辑后发挥作用[18 ] 。
Zeng Yan 等研究发现,RNA 干涉仅发生在细胞质中,细胞核中还没有运出成熟mRNA ,并不降解。当mRNA 一旦运出核孔,马上就被RISC复合体识别并降解[19 ] 。可见, RNA 干涉是细胞质中基因异常表达的监视系统。
RNA 干涉有以下特点: (1) 特异性。RNA 干涉能够非常特异地只降解与之序列相应的内源基因的mRNA ,根据不同目的基因结构序列合成的双链RNA 所产生的效应存在着显著差异,外显子序列的双链RNA 能产生特异和高效的基因抑制作用,而只针对内含子序列的双链RNA 则不能产生这种作用。(2) 高效性。RNA 干涉抑制基因表达具有很高的效率,对目的基因表达的抑制程度可以达到缺失突变体表型的程度;而且数量相对很少的双链RNA 分子(数量远少于内源mRNA 的数量) 就能完全抑制相应基因的表达,这表明RNA 干涉效应中存在信号分子的扩增机制。(3) 传染性。双链RNA 分子能够通过细胞膜、细胞间隙和细胞屏障而被转运。如经线虫小肠微注射或者浸润喂食线虫的方法进入其体内的双链RNA 能被有效转运至全身各处,在各组织中对靶基因进行抑制,在体细胞__和生殖细胞中都能检测到RNA 的表达,并且其子代也产生了对靶基因强烈而特异的抑制效应。这说明RNA 干涉机制中可能存在维持mRNA 降解序列特异性的信号分子。但这种遗传只限于子一代,子二代往往又回复到野生型。
3 RNA 干涉对基因功能的研究
RNA 干涉现象广泛存在于真核生物中, 一方面具有抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、防止自私基因序列过量增殖、对生物体的发育和基因表达调控起着重要的作用;另一方面也使得RNA 干涉技术在基因功能的研究方面具有广阔的前景,是进行大规模基因功能研究的有效的反向遗传分析工具。与基因敲除(knock out) 相比,RNA 干涉在功能基因组研究中有很大的优点: (1) 简便性。由于基因敲除技术受基因组中相近序列及复杂的同源重组的限制,往往操作费时、复杂,被敲除的基因的功能又不能直接迅速地体现出来;经过复杂的操作只能一次敲除一个基因。而RNA 干涉技术可以迅速地抑制目的基因的表达,尽快了解到目的基因的功能;并且可以利用同一基因家族多个基因所具有同源性很高的保守序列的特性,设计针对这一序列的双链RNA 分子,注射这种RNA分子就可以同时抑制多个基因的表达。(2)可恢复性。RNA 干涉对目的基因的抑制作用仅在当代和子一代表现,而子二代,基因的表达活性又可以恢复,这样更有利于对功能基因组的研究;基因敲除技术只能使基因永久失去活性,很难体现基因在整个生命活动的不同时期的动态变化。
如今通过RNA 干涉技术已对真菌、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、拟南芥等多种物种的很多基因的功能进行了研究,取得了惊人的成果。2000 年,Fraster 等与Gonczy 等将RNA干涉作为基因筛选技术大规模用于后基因组研究中,筛选出了与线虫染色体Ⅰ和染色体Ⅲ中早期胚胎细胞分裂及细胞代谢等有关的所有基因功能[20 ,21 ] 。2001 年,Bernstein 等通过对RNase Ⅲ家族的鉴定, 确定在果蝇里RNA 干涉过程中降解dsRNA 的关键酶是Dicer[21 ] 。在家蚕基因组研究领域,Quan GX.在研究白卵基因Bmwh3 的功能时,采用向卵内注射双链小RNA 的方法,抑制了白卵基因Bmwh3 的表达,使家蚕表现出油蚕性状[22 ] 。这表明蚕中也有RNA 干涉机制,从而为我们采用RNA 干涉技术研究家蚕基因的功能提供了依据。Wianny 等与Svoboda 等分别在小鼠胚胎与卵母细胞中完成了RNA 干涉实验[23 ,24 ] 。Elbashir 等将人工合成的21nt dsRNA 导入人胚胎肾细胞中, 产生了特异的RNA 干涉,表明dsRNA 在哺乳动物中也能诱导产生特异的基因沉默[25 ] 。在植物基因功能的研究中,Chuang C. F. 等人构建了可以在细胞内转录为双链RNA 的DNA 嵌合结构,利用农杆菌把此结构转化到拟南芥中,成功地利用RNA 干涉作用证实了拟南芥中与花发育有关的基因的功能[26 ] ,并证明RNA 干涉在对应的转基因植物中是稳定的,并且可以传给后代。
虽然RNA 干涉的作用机制仍不十分清楚,但近年来作为功能基因研究的有效的反向遗传分析工具,已被普遍用于真核生物基因功能的研究领域,并研究出了注射、添食、体内表达等多种简便易行的RNA 干涉技术, 以适应人们对不同生物基因功能的研究, 同时也为人类利用RNA 干涉技术进行疾病治疗带来了希望。
