2、DNA载体
由于在哺乳动物和果蝇中不存在RNAi的扩增机制，导入以上RNA产生的RNAi作用不可避免的具有瞬时性。为了克服这个弱点，一些研究小组发展了基于DNA载体在体内表达siRNA的技术。这种载体可以是质粒，也可以是病毒，甚至可以是DNA片段。
（1）基于RNA聚合酶II启动子的表达系统：在弱或无干扰素应答反应的组织或细胞中，可以构建长的发夹RNA，进一步由Dicer剪切成siRNA。这种表达系统的优点是允许组织或细胞特异性的dsRNA表达，但是绝大部分哺乳动物细胞对长的发夹RNA的干扰素应答而产生非特异作用，限制了此类表达系统的广泛应用。
（2）基于RNA聚合酶III启动子的表达系统：目前主要应用的是U6启动子和H1启动子，一方面它们在体内有较高的转录效率，另一方面以数个连续T为终止信号，限制了RNA的大小从而不引起干扰素的非特异作用。此种表达系统还可分成三类：一是基于发夹RNA的基因沉默效应而设计的表达发夹RNA的质粒载体；二是在载体上构建两个启动子分别表达siRNA的正义RNA和反义RNA；三是共同导入分别表达siRNA的互补片段的含有U6或H1启动子的DNA片段，或者表达发夹RNA的DNA片段。尤其是后者，可以用PCR方法方便的获得，大大扩展了其应用。[1]
四、RNAi的问题与前景
尽管RNAi技术飞速发展，但在机制研究和应用方面还存在着许多问题。在机制方面，至今仍不完全清楚的有：RISC的组成成份，它是否与miRNP是一致的，或者是部分一致的；RISC的组装步骤，其相关蛋白是如何与siRNA组合在一起的，如何成为活性形式等；以及对靶RNA的剪切作用，其相关的分子机制如何，是需要特异的蛋白来剪切靶RNA，还是引导的siRNA本身即有剪切作用等。在许多真核生物中都发现了RNAi现象，而在原核生物中却未发现，提示了RNAi的进化地位，但是其在进化中是如何出现的，如何保存下来的，在生物体中的意义有多大，目前均没有分析清楚，还需要更多的研究来阐明。
在基础研究应用方面，因为不完全互补的siRNA也可能抑制基因的表达，虽然其机制和相关的RNA序列要求仍未知，但有可能对RNAi的特异性提出挑战，RNAi不能完全区别出仅有几个碱基的突变。而靶RNA上与siRNA结合的部位特征还须进一步的确认，以提高siRNA设计的效率。
在应用研究领域，最主要的问题还是转运系统的选择，如何找到一种高效而低毒的用于人体的转运载体是摆在所有RNAi应用面前的最大敌人。
总之，随着RNAi研究的进一步深入，对RNAi机制的进一步理解，以及解决应用方面的限制因素，RNAi将是基因功能研究和疾病基因治疗的革命性工具。
